FUSIONS CELLULAIRES

FUSIONS CELLULAIRES

Depuis le début des années soixante, il est possible de fusionner des cellules somatiques entre elles. Ce mode de croisement est bien distinct de celui qui s’opère lors de la reproduction sexuelle. Il constitue néanmoins une approche alternative et très fructueuse de la génétique moderne humaine.

Cette méthode de croisement par fusion cellulaire, encore appelée hybridation cellulaire, a été découverte en 1960 par Georges Barski, Serge Sorieul et Francine Cornefert de l’institut Gustave-Roussy de Villejuif. Ces auteurs ont étudié la fusion spontanée de deux souches cellulaires, issues de lignées tumorales de souris, qui différaient par quelques caractères, en particulier chromosomiques. Ils observent l’apparition d’un troisième type cellulaire dont les caractéristiques sont intermédiaires entre celles des deux souches parentales de souris. L’étude des chromosomes montra que ces cellules, d’un type nouveau, contenaient à l’intérieur d’un même noyau les chromosomes des deux lignées parentales. Il s’agissait de cellules hybrides résultant de la fusion cellulaire. Cette fusion spontanée n’allait pas rester une simple curiosité de laboratoire. Barski et ses collaborateurs obtinrent ensuite d’autres hybrides cellulaires par croisement de différentes lignées cellulaires.

Malgré cela, la communauté scientifique resta sceptique car ce phénomène de fusion était fort rare et sa caractérisation reposait uniquement sur des analyses chromosomiques. Il n’allait pas tarder cependant à être rapidement reproduit par plusieurs équipes; d’abord, en 1961, par Ephrussi et Sorieul; puis, en 1963, par Gershar et Sachs. Cette dernière équipe démontra que ces hybrides cellulaires portaient des caractéristiques de groupes sanguins (antigènes d’histocompatibilité) des deux cellules parentales, ce qui démontrait que les deux lots de chromosomes réunis dans le même noyau étaient fonctionnels de telle sorte que les hybrides cellulaires exprimaient les caractères héréditaires des deux parents. Nous nous trouvons donc devant l’équivalent génétique d’un hybride ¹.

En quinze ans, trois séries de découvertes vont montrer toute l’importance de l’observation de Barski, Sorieul et Cornefert. Tout d’abord en ce qui concerne la fréquence de fusion , en 1965, et, indépendamment, trois groupes (Harris et Watkins; Okada et Murayama; Ephrussi et Weiss) démontrent qu’elle peut être augmentée par des virus comme le virus Sendaï. Dix ans plus tard, Pontecorvo découvre le pouvoir fusionnant d’un agent chimique: le polyéthylène glycol dont les propriétés agglutinantes multiplient par 100 ou par 1 000 la fréquence des fusions et sans introduire, comme c’est le cas avec les virus, aucun matériel génétique étranger.

Un dernier obstacle devait disparaître en 1964 lorsque John Littlefield inventa un système permettant l’isolement sélectif des cellules hybrides . En effet, lorsqu’une fusion est réalisée, deux souches cellulaires sont mises en présence. On assiste à l’apparition d’un troisième type cellulaire qui est l’hybride. Seul ce dernier intéresse l’expérimentateur, qui doit donc éliminer les deux types cellulaires parentaux et ne conserver que les hybrides cellulaires. Littlefield utilise, dans son expérience, deux sortes de cellules mutantes, déficientes pour deux enzymes distinctes, intervenant dans la synthèse de l’ADN, et nécessaires pour la croissance cellulaire en présence d’un inhibiteur, l’aminoptérine. Lorsque les cellules hybrides se forment, elles sont seules capables de pousser en présence d’aminoptérine, par un phénomène de complémentation génétique où chacune des cellules parentales apporte la fonction qui manque chez l’autre parent. C’est pourquoi seules les cellules hybrides ont la possibilité de pousser dans un milieu sélectif contenant de l’aminoptérine. Depuis cette découverte, un grand nombre d’autres systèmes sélectifs ont été mis au point; ils permettent d’obtenir facilement et en quelques semaines un grand nombre d’hybrides cellulaires.

La troisième étape importante a été réalisée en 1967 par Mary Weiss et Boris Ephrussi à Gif-sur-Yvette au centre de génétique moléculaire du C.N.R.S. Ils ont croisé des cellules de souris avec des cellules humaines. Fait surprenant, des caractères humains, comme des enzymes ou des groupes sanguins, s’exprimaient tout à fait normalement au voisinage de caractères murins. Ainsi des gènes des deux parents étaient fonctionnels en même temps dans les hybrides. Cependant, Mary Weiss constate que ces clones de cellules hybrides n’étaient pas tous identiques entre eux. Certains ressemblaient plus, à des degrés variables, aux cellules de souris qu’aux cellules humaines. L’examen chromosomique révéla la raison de cette hétérogénéité des caractères des hybrides homme x souris. En effet, s’ils contenaient tous les chromosomes de la souris, ils ne contenaient pas tous les 46 chromosomes humains attendus, mais seulement entre 2 et 15 (fig. 1 et 2). Mary Weiss arrive à la conclusion qu’il y a donc une perte préférentielle des chromosomes humains. Cette perte, ou encore ségrégation des chromosomes humains, se fait au hasard: certains hybrides homme x souris contenant un petit nombre de chromosomes humains, parfois un seul. Ce résultat est à la base de la principale utilisation de la découverte de Barski, Cornefert et Sorieul: l’établissement de la carte génétique humaine.

1. Découverte de l’hybridation des cellules somatiques

Le principe dominant dans l’organisation anatomique et physiologique des êtres pluricellulaires, animaux et végétaux, est la différenciation que l’on peut définir comme l’acquisition par les cellules, qui composent les divers tissus de ces organismes, de propriétés structurales et fonctionnelles différentes. Ces propriétés, acquises essentiellement au cours du développement embryonnaire, mais aussi au cours des processus de régénération ou de réparation, sont dans l’ensemble héréditaires et irréversibles. La sauvegarde de ces propriétés différenciées des cellules somatiques est assurée malgré les contacts et interactions intenses entre cellules diversifiées, au sein de tissus et d’organes. La nature de ces interactions, qui jouent d’ailleurs un rôle essentiel dans le développement embryonnaire (ontogenèse) et la différenciation, est encore à l’étude, mais elle est envisagée comme fondée uniquement sur l’émission et la captation intercellulaires de signaux de nature certainement chimique. La promiscuité cellulaire telle qu’on l’observe dans le monde des organismes monocellulaires, et qui se traduit notamment par la copulation et la fusion des cellules différentes avec comme résultat la formation de cellules hybrides, paraissait inimaginable dans le cas des êtres pluricellulaires.

Cependant, le développement prodigieux de la génétique bactérienne, dû en grande partie au procédé de croisement contrôlé entre bactéries sexuellement différenciées, procédé développé à l’Institut Pasteur dans les années 1950-1955 par Wollman et Jacob, a encouragé les efforts visant à explorer les possibilités d’interaction au niveau génétique entre cellules somatiques des animaux supérieurs, cultivées in vitro dans des conditions similaires à celles qui sont couramment pratiquées en microbiologie.

En 1960, un pas décisif a été franchi dans ce sens par Barski et ses collaborateurs à l’institut Gustave-Roussy de Villejuif. Ces chercheurs ont obtenu, dans les cultures mixtes in vitro de deux souches de cellules somatiques différentes, des cellules hybrides, produit manifeste de la fusion et de l’intégration génétique de deux unités cellulaires distinctes.

Des circonstances particulières ont facilité cette démonstration. Les cellules de souris choisies pour ces premières expériences avaient des caractéristiques très différentes: l’une d’elles possédait un caryotype composé de nombreux chromosomes «marqueurs» à deux bras, inhabituels pour la souris, et était dépourvue de propriétés tumorigènes; l’autre, ayant un caryotype assez proche de la normale, à l’exception d’un chromosome marqueur extra-long, était hautement maligne. De plus, les deux souches avaient des morphologies très différentes, faciles à distinguer.

La nouvelle cellule hybride était reconnaissable d’emblée par la présence simultanée, dans son caryotype, des deux garnitures chromosomiques réunies presque intégralement.

Les cellules hybrides, isolées à partir des cultures mixtes, se sont montrées parfaitement viables et ont pu être développées en populations clonales pures qui ont conservé, malgré un certain degré de ségrégation chromosomique, leurs propriétés essentielles, et notamment leur caryotype «hybride» et leur morphologie «intermédiaire», ainsi que des propriétés tumorigènes, héritées du parent malin.

Ces résultats ont été, par la suite, dans les années 1962-1964, largement confirmés et élargis par Ephrussi et ses collaborateurs à Gif-sur-Yvette. Ainsi une voie nouvelle a été ouverte en biologie expérimentale. On pouvait dorénavant espérer que les croisements sexuels, outil principal, depuis les travaux mémorables de Mendel, d’analyse génétique des phénomènes d’hérédité chez les êtres supérieurs, pouvaient être remplacés ou au moins secondés par le procédé de croisement entre cellules somatiques cultivées in vitro , se reproduisant à une cadence proche de celle des micro-organismes, c’est-à-dire présentant une succession de générations jusqu’à mille fois plus rapide que celles des organismes correspondants arrivant à leur maturité sexuelle.

De plus, l’hybridation cellulaire offrait des possibilités entièrement nouvelles d’approcher directement des problèmes concernant l’hérédité spécifique aux cellules somatiques, dont la différenciation fonctionnelle et structurale ou la transformation maligne constituent les exemples les plus frappants.

Cependant, un certain nombre de problèmes méthodologiques devaient être résolus afin de rendre le procédé d’hybridation cellulaire couramment praticable.

2. Conditions expérimentales

Il est évident que l’hybridation cellulaire s’opère en plusieurs étapes: d’abord fusion entre cellules au niveau de leurs cytoplasmes, avec formation de polycaryocytes englobant des noyaux provenant de cellules différentes, puis intégration de deux, parfois trois génomes en une seule unité nucléaire capable de se reproduire en tant que telle, et conduisant par une succession de mitoses vers l’établissement d’un nouveau clone cellulaire hybride.

La fusion cytoplasmique

La fusion cytoplasmique spontanée est un phénomène relativement rare dans les conditions physiologiques. Elle est, toutefois, observée assez fréquemment dans des populations cellulaires soumises à l’action de certains virus. Le chercheur japonais Okada a démontré, en 1961, que la propriété fusionnante des virus appartenant à la famille des myxovirus, le virus HVJ ou Sendaï notamment, est maintenue même après leur inactivation par irradiation aux ultraviolets, qui leur enlève l’infectivité. Okada a ainsi trouvé le moyen d’intensifier artificiellement par virus les fusions cytoplasmiques tout en évitant la propagation dudit virus dans les cultures cellulaires ainsi traitées. Ce procédé est, actuellement, largement employé en vue de l’obtention d’hybrides par association de cellules non seulement de la même espèce, mais aussi d’espèces différentes. Okada et Murayama (1965), ainsi que Harris, Watkins et leurs associés (1965), ont démontré que, dans les hétéropolycaryocytes obtenus par la fusion de cellules aussi différentes, par leur nature et leur espèce d’origine, que celles d’un carcinome humain, d’une tumeur ascitique de souris, des macrophages de lapin ou des globules rouges de poulet, les noyaux non seulement manifestent leur activité synthétique propre, mais montrent un réveil de cette synthèse, visiblement sous l’effet du partenaire nucléaire actif.

Il est à remarquer que la plupart des polycaryocytes formés sous l’effet de virus, surtout s’ils contiennent de très nombreux noyaux – ce qui est souvent le cas –, constituent des unités biologiques éphémères, non viables à la longue, et n’évoluent pas vers la formation d’hybrides nucléaires vrais capables de se reproduire. Néanmoins, leur étude fournit des renseignements précieux sur les relations nucléocytoplasmiques et les mécanismes impliqués dans l’expression des fonctions essentielles de la cellule.

Des efforts importants sont déployés dans le but de trouver des facteurs chimiques agissant sur les membranes cellulaires et favorisant leur fusion qui soient mieux définis, plus faciles à contrôler et à doser que ne le sont les préparations virales.

L’intégration des génomes

Lors de la formation d’une cellule hybride, sa perpétuation exige:

– une synchronisation des processus de synthèse, celle des acides désoxyribonucléiques (ADN) en particulier, et sa conséquence: la maturation synchrone des chromosomes qui sont apportés par les deux partenaires cellulaires fusionnés;

– un fonctionnement non perturbé et efficace de l’appareil mitotique.

L’intégration de deux génomes parentaux, la coordination de leur maturation ainsi que l’activité régulatrice non perturbée du centrosome et du fuseau mitotique unique sont faciles à imaginer dans le cas des hybrides obtenus par fusion des cellules homologues, originaires de la même espèce.

Ces phénomènes de synchronisation et de coordination apparaissent, cependant, comme beaucoup plus surprenants dans le cas des hybrides interespèces. De tels hybrides, résultant du croisement entre cellules de rat et de souris, ont été obtenus pour la première fois par Ephrussi et Weiss en 1965. Ils ont été suivis par d’autres, issus du croisement entre cellules de hamster chinois et de souris, d’homme et de souris, de hamster chinois et arménien, de veau et de vison. Cette liste est loin d’être complète. Ces cellules hybrides, constituant des créations de laboratoire totalement artificielles, se sont révélées parfaitement viables, gardant pendant des générations successives leur caractère mixte, illustré par la présence simultanée et constante, malgré des remaniements plus ou moins importants, des chromosomes caractéristiques pour les deux espèces parentales.

Il est devenu ainsi évident, quoique inattendu, que les mécanismes de surveillance et de répression, dirigés dans les organismes supérieurs contre toute intrusion d’éléments étrangers, et notamment des mécanismes qui empêchent la fécondation interespèces, peuvent être surmontés ou trompét par l’artifice de l’hybridation somatique.

Le point crucial de la «réussite» de l’hybride cellulaire, surtout lorsqu’il s’agit d’un hybride hétérologue interespèces, est lié à la coordination des processus de synthèse sous l’égide du noyau hybride néoformé. L’exemple de cette synchronisation est fourni par le cas de fusion entre cellules des lignées adaptées à une multiplication rapide in vitro et cellules «sénescentes» dont la reproduction est pratiquement arrêtée. Les hybrides issus de ce genre d’association se sont révélés capables d’une prolifération soutenue et montraient souvent un rythme de reproduction assez proche de celui du partenaire cellulaire le plus actif. La «jeunesse» cellulaire est apparue dans ces cas comme dominante.

Une notion fondamentale qui se dégage de ces expériences est qu’à une échelle très étendue, dépassant visiblement les limites de l’espèce et même de l’ordre, le contenu et la séquence des processus de synthèse cellulaire sont d’une même nature, et que les signaux intracellulaires déclenchant et réglant ces processus sont exprimés dans un langage largement, sinon universellement, «intelligible», ou plus précisément traductible.

Certes, les hybrides cellulaires qui réussissent à la longue une coordination et une synchronisation satisfaisantes de leurs deux génomes unifiés ne sont pas les seuls possibles. Ils représentent un choix de cas favorables. Il a été, en effet, démontré que seule une proportion relativement faible de cellules fusionnées au niveau de leur cytoplasme aboutit au stade d’une mitose mixte productive, conduisant vers une lignée cellulaire hybride génétiquement équilibrée. D’ailleurs, cet équilibre est souvent atteint seulement après la perte d’un certain nombre de chromosomes de l’un ou de l’autre partenaire cellulaire. Le degré et le sens de cette ségrégation chromosomique ne sont pas toujours prévisibles, sa signification ainsi que les mécanismes qui la déterminent sont encore inconnus. Toutefois, ce phénomène semble obéir à certaines règles ou au moins suivre certaines tendances. Ainsi, comme l’ont observé Weiss et Green (1967) lors du croisement des cellules humaines normales ou transformées avec des cellules de souris, la participation des chromosomes humains dans les hybrides diminue progressivement pour se réduire, au bout d’une vingtaine de générations in vitro , à douze et dans certains cas même à trois seulement, à partir d’un chiffre initial d’une cinquantaine de chromosomes humains présents dans les cellules parentales.

Un autre exemple de ségrégation chromosomique extrême est fourni par le croisement entre cellules de souris et de hamster chinois: dans plusieurs cas d’une telle association, Barski et ses collaborateurs (1972) ont obtenu des cellules hybrides représentant un «triplet» composé approximativement de deux garnitures chromosomiques de souris associées avec une moitié, à peine, de chromosomes de hamster.

Sélection et isolement

En toute circonstance, cependant, le sort des hybrides dépendra autant de leur capacité propre de survie que de leur environnement «social», c’est-à-dire de leur compétitivité au milieu de la population cellulaire mixte comprenant au départ, en majorité écrasante, les cellules parentales. Dans certains cas, plutôt exceptionnels, les hybrides montrent une vigueur particulière qui favorise leur croissance au sein de cette population, permettant ultérieurement leur mise en évidence et leur isolement. Toutefois, le plus souvent, l’avantage ne joue pas nécessairement en faveur des cellules hybrides, et l’on est conduit, en vue de leur accumulation, à recourir à des systèmes sélectifs plus ou moins artificiels. Un de ces systèmes, inventé en 1964 par Littlefield, est couramment employé. Il est fondé sur l’utilisation, en vue de fusion et d’hybridation, de mutants cellulaires présentant des déficiences enzymatiques (telles que l’absence de pyrophosphorylase d’acide inosinique ou de thymidine-kinase) qui rendent ces mutants incapables de se multiplier dans un milieu sélectif spécialement conçu et contenant, en plus de précurseurs des acides nucléiques, de l’aminoptérine. Dans ces conditions, seules les cellules hybrides dans lesquelles se reconstitue, par une compensation génétique réciproque, l’appareil enzymatique intégral sont capables d’accomplir le cycle normal de synthèse d’acides nucléiques et, par conséquent, de se reproduire.

Un autre système permettant l’isolement sélectif d’hybrides a été inventé par Puck et ses collaborateurs (1969). Il repose sur l’utilisation de mutants cellulaires dont la croissance in vitro est dépendante de la présence dans le milieu de culture d’un acide aminé particulier tel que la glycine ou la proline. La fusion de ces mutants permet dans certains cas d’isoler des hybrides «compensés», capables de pousser dans les milieux déficients. Cela se produit dans le cas où les défauts génétiques des mutants fusionnés dépendent des gènes situés sur des chromosomes différents.

En pratique, l’utilisation d’un système comportant un couple cellulaire représentant deux déficiences enzymatiques, capables de se compenser mutuellement, n’est pas toujours nécessaire. Il suffit, en effet, afin de faciliter l’isolement de l’hybride, qu’un des deux partenaires, tout en étant métaboliquement normal, puisse être éliminé de la culture mixte en vertu de sa croissance très lente, comme c’est le cas, déjà cité, des cellules «sénescentes», ou en vertu de son incapacité d’adhérer aux parois du récipient de culture. On pourrait citer encore d’autres exemples où l’ingéniosité des expérimentateurs met à profit des propriétés biologiques distinctives des hybrides en vue de leur sélection, accumulation et isolement. Une de ces propriétés est, à l’évidence, la faculté de produire une croissance tumorale, faculté qui peut, comme cela a été démontré dans les premières expériences de Barski et de ses collaborateurs (1961), s’exprimer chez les hybrides lorsqu’elle est présente chez une des deux cellules parentales. Il est alors souvent aisé d’isoler les cellules hybrides à partir des tumeurs qu’elles produisent, après avoir remis ces tumeurs en culture in vitro .

3. Hybridation somatique «in vivo»

Depuis la découverte de l’hybridation somatique, on s’est posé la question de savoir si cette hybridation est strictement limitée aux conditions très particulières de la culture in vitro . Comme nous l’avons déjà mentionné, les fusions cytoplasmiques peuvent avoir lieu également in vivo . En serait-il de même pour des fusions internucléaires productives, conduisant vers la formation in vivo des lignées cellulaires hybrides? D’emblée, on pourrait penser qu’une telle possibilité est exclue puisque contraire au principe qui domine la structuration et l’organisation anatomique des métazoaires, principe qui repose sur la préservation très stricte de la différenciation cellulaire. Cependant, plusieurs faits expérimentaux prouvent que, dans certaines conditions au moins, qui s’écartent, il est vrai, des normes physiologiques, des hybridations entre cellules somatiques peuvent se produire également in vivo . On peut citer ainsi les observations de Stone et ses collaborateurs (1964) sur des veaux jumeaux non consanguins qui, à la naissance, montraient dans leur sang la coexistence tolérée de deux types antigéniques de globules rouges. Or, au bout de quelques années, Stone a constaté chez ces animaux l’apparition de globules rouges d’un type hybride qui ne pouvait s’expliquer que par la fusion productive de deux types cellulaires présents initialement dans leur moelle osseuse. Un phénomène similaire a été reproduit expérimentalement par des chercheurs tchèques (Karakoz et coll., 1969) chez des poulets allogéniques maintenus en parabiose au cours de leur développement embryonnaire et traités, pour favoriser les fusions cellulaires, par injection d’une préparation virale appropriée. Wiener et ses collaborateurs (1972) ont prouvé qu’une hybridation peut se produire également entre des cellules d’une tumeur implantée chez la souris et les cellules normales du substrat de cette tumeur qui accompagnent la croissance maligne (cellules du stroma tumoral). Puisque les cellules hybrides se sont montrées, à leur tour, douées de propriétés envahissantes, ce fait explique sans doute les cas bien connus de malignisation du stroma tumoral observés parfois en pathologie humaine.

4. Analyse de la relation génotype-phénotype

L’hybridation cellulaire est apparue d’emblée comme un moyen nouveau et un outil expérimental exceptionnel permettant l’analyse du contenu génétique des cellules somatiques et du mode d’expression de ce contenu dans le phénotype cellulaire sous la forme de structures particulières, d’équipement enzymatique et de fonctions spécifiques. Les voies d’abord étaient multiples.

Lors des premières expériences d’hybridation entre cellules de différentes lignées consanguines de souris, on a pu constater que les antigènes d’histocompatibilité réglant les phénomènes d’acceptation ou de rejet de greffe se comportaient, d’une manière générale, comme dans le cas d’hybridation sexuelle: les cellules issues de l’hybridation somatique étaient acceptées par les souris nées du croisement entre les deux lignées de souris en question, mais rejetées par les souris des lignées parentales pures qui «reconnaissaient» l’élément antigénique étranger à la surface de ces cellules. L’expression simultanée d’antigènes de surface propres aux deux composantes cellulaires a été constatée également dans le cas du croisement des cellules de deux espèces différentes. Mais, évidemment, dans ces cas, devant l’inexistence d’un hôte animal hybride correspondant, ce fait ne pouvait être mis en évidence que par des tests immunochimiques appropriés.

Comme cela a déjà été mentionné, le croisement entre deux cellules dépourvues, à cause d’une déficience génétique, de certaines enzymes peut conduire par compensation réciproque à la reconstitution d’un appareil enzymatique complet et normal. Il est assez surprenant que cette «réparation» génétique s’effectue parfaitement, même dans le cas d’une hybridation interespèces. Ainsi, dans les hybrides obtenus par fusion de cellules de souris déficientes – à cause d’une mutation expérimentalement induite – en thymidine-kinase (une enzyme contribuant à la synthèse d’acides nucléiques) avec des cellules humaines possédant les gènes déterminant la synthèse de cette enzyme, cette dernière se montre parfaitement fonctionnelle. Il semble bien, puisque d’autres exemples similaires ne manquent pas, que cette polyvalence interespèces de l’équipement enzymatique, qui peut être génétiquement «greffé» d’une cellule à l’autre, constitue une règle générale.

Un pas a été franchi lorsque l’analyse biochimique (effectuée par des procédés de fractionnement électrophorétique) a révélé la présence dans les hybrides non seulement des enzymes en provenance de chacune des deux espèces entrant dans la composition de l’hybride, mais aussi des enzymes ayant des propriétés physiques «mixtes». Ainsi on s’est trouvé devant un fait nouveau: l’hybridation au niveau moléculaire , faisant suite à celle des cellules.

On peut ajouter que la réparation génétique par voie d’hybridation cellulaire a été réalisée également dans des cas de déficience enzymatique naturelle, propre aux cellules provenant des sujets atteints de certaines maladies héréditaires graves. Cette réparation a été obtenue jusqu’ici in vitro , mais il n’est pas interdit de penser qu’elle puisse un jour ouvrir la voie vers des applications médicales.

L’étude du rapport entre la participation plus ou moins complète des chromosomes en provenance des deux cellules parentales dans la constitution du caryotype hybride et l’expression dans ces hybrides des caractères héréditaires reconnaissables est à l’évidence particulièrement instructive, puisqu’elle est susceptible de nous renseigner sur la localisation chromosomique des gènes déterminant ces caractères. Cette étude concernant tout spécialement le génome humain s’est poursuivie dans des conditions particulièrement favorables depuis que Weiss et Green (1967) ont constaté que, dans les hybrides cellulaires homme-souris, les chromosomes humains ont tendance à disparaître progressivement. Ainsi, lorsque leur nombre est réduit à quelques-uns, dans la plupart des cas facilement identifiables et distincts de ceux des souris, il devient possible d’établir un rapport entre la présence de ces chromosomes résiduels et les «caractères humains» encore exprimés dans les hybrides. On est parvenu ainsi à localiser pour la première fois certains gènes humains comme responsables de la synthèse de plusieurs enzymes et à établir également des rapports de localisations chromosomiques contribuant à l’établissement de la «carte» de ces localisations.

Un autre domaine dans lequel l’hybridation somatique a apporté des connaissances nouvelles, est celui de la différenciation cellulaire , ce phénomène, d’importance capitale, déterminant la structuration complexe et le fonctionnement à la fois diversifié et coordonné des organismes pluricellulaires. Il est généralement admis que la différenciation cellulaire est déterminée par une «dérépression» dans les cellules à fonction spécialisée d’un nombre limité de gènes, les autres restant réprimés et «silencieux». Le mécanisme et la nature de cette dérépression sélective restent inconnus.

Des éclaircissements importants dans ce domaine devaient être apportés par des expériences dans lesquelles des cellules différenciées ayant un équipement, des structures et des fonctions particulières étaient hybridées avec des cellules non différenciées telles que, par exemple, des fibroblastes du tissu conjonctif embryonnaire. En hybridant des cellules d’une tumeur mélanique de hamster syrien avec des fibroblastes non pigmentés de souris, Davidson, Ephrussi et leurs collaborateurs (1966) ont démontré que la fonction «spécialisée», qui est celle de la production de pigments, est réprimée chez les hybrides. D’autres expériences portant sur l’hybridation des cellules de mélanome ou des cellules d’hypophyse de rat produisant l’hormone de croissance, ou encore des cellules de tératome (tumeur maligne à potentialités multiples de différenciation histologique) avec des fibroblastes dédifférenciés, ont donné des résultats semblables, c’est-à-dire une «extinction» chez les hybrides des fonctions spécialisées. Selon le concept de Davidson, Ephrussi et leurs associés (1969), ce phénomène serait dû à la présence dans les cellules dédifférenciées d’un inhibiteur-répresseur dont l’action continuerait à s’exercer dans les cellules hybrides.

Cependant, cette règle n’est applicable qu’avec réserve puisque, comme l’ont démontré Green et ses collaborateurs (1966), puis Paterson et Weiss (1973), la synthèse de certaines protéines plus «banales» comme celle du collagène ou de l’albumine sérique n’est pas soumise à l’«extinction», même si elle est nulle ou très réduite chez un des deux partenaires cellulaires.

Ainsi le nouvel outil que constitue l’hybridation cellulaire, appliquée à l’étude de la différenciation des cellules somatiques, commence à nous dévoiler les modalités de ce phénomène qui est manifestement d’un autre ordre de complexité que tout ce qui a été déjà considérablement exploré dans le domaine de fonctions cellulaires spécialisées chez les organismes monocellulaires.

5. La question de la transformation maligne

Depuis sa découverte en 1960, l’hybridation des cellules somatiques in vitro s’est révélée comme un moyen nouveau d’étudier, parmi d’autres mécanismes d’hérédité cellulaire, celui qui concerne la transmission à sa descendance du pouvoir tumorigène de la cellule. De nombreuses expériences ont été entreprises dans le but de suivre l’expression des propriétés invasives dans les hybrides obtenus par croisement entre cellules malignes et non malignes. Dans bon nombre de ces expériences, lorsque le pouvoir tumorigène des cellules hybrides a été éprouvé par inoculation chez un hôte histocompatible, les hybrides se sont montrés, en ce qui concerne leurs propriétés cancéreuses, proches des cellules parentales malignes. Cela a été le cas pour plusieurs hybridations entre cellules isologues ou homologues de souris ou de hamster chinois. Dans le cas particulier où le partenaire cellulaire malin fut une cellule transformée par un virus oncogène, on pouvait retrouver, chez les hybrides, à la fois la malignité et le «néoantigène» spécifique induit par le virus responsable de la transformation cancéreuse de la cellule parentale.

Cependant, au moins dans certains cas, décrits par Harris, Klein et leurs collaborateurs (1969-1973), de croisement entre des cellules hautement malignes, en provenance des tumeurs ascitiques surtout, et des cellules non cancéreuses, les hybrides se sont révélés d’emblée dépourvus de propriétés malignes. Leur malignité pouvait, toutefois, réapparaître à la suite d’une perte considérable de chromosomes à partir des cellules hybrides. Ces auteurs ont émis l’hypothèse selon laquelle l’élément cellulaire non tumorigène introduit dans l’hybride un facteur qui supprime son caractère malin. Ce caractère peut, pourtant, s’exprimer si le facteur en question est éliminé lors d’une perte spécifique de certains chromosomes. Cependant, la recherche du chromosome et des chromosomes «normalisateurs» hypothétiques n’avait pas conduit à leur identification malgré l’emploi par Wiener, Klein et Harris (1973) d’une méthode perfectionnée d’analyse des chromosomes traités par colorants fluorescents. Cette analyse est d’autant plus difficile qu’elle doit s’accommoder d’une variabilité chromosomique considérable observée dans toute lignée cellulaire adaptée in vitro et transformée, ce qui est vrai également pour les hybrides, surtout ceux qui comportent un partenaire malin.

Ainsi le débat reste ouvert sur la question primordiale de savoir si la malignité, telle qu’on la voit transmise et exprimée notamment dans les hybrides somatiques, peut s’expliquer entièrement par une délétion spécifique de certains chromosomes «normaux». Dans l’alternative, on admettrait que la malignisation correspondrait à l’apparition d’une information génétique ou épigénétique nouvelle susceptible d’être réprimée par l’apport d’un élément venant d’une cellule non cancéreuse.

Ensuite, les recherches sur l’expression des propriétés tumorigènes ont été étendues aux hybrides obtenus par croisement entre cellules provenant d’espèces différentes comme celles de la souris et du hamster (Barski et coll., 1973). Dans ces cas, l’épreuve du pouvoir tumorigène devait être, en l’absence d’un hôte animal compatible, effectuée par hétérogreffe dans un système immunotolérant approprié. Il a été démontré dans ces conditions que les hybrides, cumulant dans leur génome des éléments en provenance de deux espèces différentes, peuvent hériter et exprimer des propriétés malignes propres à l’une des deux cellules parentales. Cette règle n’est pas absolue puisque certains clones ou lignées des hybrides interespèces apparaissent comme dépourvus de propriétés tumorigènes, sans qu’on puisse d’ailleurs l’expliquer par des modifications chromosomiques spécifiques évidentes. Il est toutefois remarquable que, même dans ce cas, les hybrides peuvent hériter de leur parent malin non seulement les antigènes propres à l’espèce, mais aussi les antigènes spécifiques de la transformation cancéreuse. On obtient ainsi des hybrides non malins dotés d’une triple antigénicité: celle de deux parents, plus celle de la tumeur. L’expérience montre que ces hybrides, rejetés à double titre lorsqu’on les inocule chez les animaux qui ont fourni les cellules parentales malignes, peuvent rendre ces animaux immuns contre leurs propres cellules tumorales.

La fusion et l’hybridation entre cellules des espèces différentes ont révélé d’une autre manière encore leur utilité en rapport avec les problèmes posés par la transformation maligne. Il est connu que certains virus oncogènes transforment les cellules qu’ils atteignent sans s’y reproduire en forme infectieuse. Ainsi le virus s’intègre dans la cellule transformée sans se manifester autrement que par la présence d’un antigène spécifique. Or il est apparu que les virus intégrés et «silencieux» peuvent être activés si les cellules porteuses de cette infection occulte sont fusionnées avec des cellules «permissives» provenant de la même ou d’une autre espèce. Il est à remarquer que la présence d’un virus en forme intégrée est démontrée dans certains cancers, et notamment certains cancers de l’homme; l’activation des facteurs endogènes de cancérisation à l’aide de fusion et hybridation cellulaires est maintenant l’objet d’expériences poursuivies dans de nombreux laboratoires.

6. La carte génétique humaine

En 1960, on ignorait à peu près tout de la localisation des gènes sur les chromosomes humains. Vingt ans plus tard, grâce à l’hybridation cellulaire, on a réussi à situer des gènes (de 5 à 30) sur chacun des 46 chromosomes humains. Sur 3 000 marqueurs génétiques humains, environ 300 sont donc, en 1984, affectés à des chromosomes qu’ils caractérisent par conséquent.

Ces progrès spectaculaires dérivent de la découverte de Georges Barski et de son équipe. En effet, lors de la fusion entre des cellules humaines et des cellules de souris (ou avec des cellules de hamster), on observe une perte préférentielle des chromosomes humains (ségrégation). Celle-là se fait au hasard pour n’importe quel chromosome humain. Sur un grand nombre de clones hybrides est étudiée une série de marqueurs génétiques (isoenzymes ou antigènes), ayant été identifiés; il est devenu possible, en conséquence, de les suivre sur un grand nombre de clones hybrides. On pourra ou non les détecter selon que les chromosomes qui portent ces gènes sont présents ou absents dans ces différents clones hybrides. De plus, si deux marqueurs génétiques sont portés par le même chromosome humain (ils sont dits alors synthéniques), ils auront tendance à ségréger ensemble; ainsi, peut-on définir des groupes de synthénie. Enfin, en étudiant la corrélation entre un marqueur génétique et un chromosome humain, on peut aussi assigner des gènes sur des chromosomes. Cette méthode peut démontrer que deux marqueurs génétiques sont synthéniques même si ces marqueurs sont suffisamment éloignés l’un de l’autre pour qu’une liaison génétique ne puisse être retrouvée par la méthode généalogique classique (cf. HOMME – Caryotype humain).

Plusieurs méthodes ont permis d’affiner la localisation chromosomique humaine. La première est l’utilisation de cellules humaines portant des translocations chromosomiques très précises. Des anomalies de synthénies sont alors observées: par exemple, si le grand bras du chromosome X est transloqué sur le chromosome 14, tous les marqueurs génétiques portés par ce grand bras vont ségréger indépendamment de ceux portés par le petit bras du chromosome X, mais vont être synthéniques avec les marqueurs génétiques du chromosome 14. On peut donc distinguer les marqueurs génétiques du chromosome X portés par le petit bras ou le grand bras de ce chromosome. Cette approche a été largement utilisée pour l’établissement de la carte fine d’un grand nombre de chromosomes comme l’X, le 6 ou le 1.

En second lieu, la technique des microcellules, décrite par Ringertz en 1974, permet le transfert minimal de matériel génétique humain à une cellule de souris. Ici, des chromosomes isolés et enveloppés par la membrane nucléaire sont obtenus à l’aide d’une drogue, la cytochalasine. Ces microcellules, ne contenant en règle générale qu’un seul chromosome humain, sont fusionnées avec des cellules de souris. On a alors obtenu des hybrides ne portant qu’un seul chromosome humain, par exemple le chromosome X, le 6, le 16 ou le 17. Grâce à cette méthode, il existe donc un large «panel» de cellules hybrides porteuses d’un seul exemplaire des 46 chromosomes humains: cela simplifie largement l’analyse des localisations chromosomiques. De plus, ces hybrides homme-souris ne contenant qu’un seul chromosome humain sont très précieux pour fabriquer des «sondes moléculaires» spécifiques d’un chromosome comme le chromosome X, le 21 ou l’Y ^{[cf. GÉNIE GÉNÉTIQUE]}.

7. Les applications médicales de la technique de fusion cellulaire

Recherche des effets de complémentation génétique

La possibilité d’obtenir des hybrides entre des cellules provenant de malades a permis de réaliser enfin chez l’homme le test de complémentation fonctionnelle et donc de démontrer qu’il existe une hétérogénéité génétique chez des malades atteints, par exemple, de galactosémie, xerodermapigmentosum ou de syndrome de Lesh-Nyan.

Cette méthode d’analyse génétique est simple, rapide et permet d’étudier la complexité de certaines maladies génétiques. Par exemple, l’analyse d’une maladie apparemment simple comme le xerodermapigmentosum (hypersensibilité aux rayons du soleil avec risque élevé de cancer cutané) a permis de découvrir que cette maladie est due à l’existence de sept différents types de mutations avec sept groupes de complémentations génétiques fonctionnelles. Il conviendra de relier ultérieurement chacune de ces mutations à un défaut biochimique afin de développer à leur sujet des thérapeutiques nouvelles.

Hybridomes et production d’anticorps monoclonaux

Une des premières applications de l’hybridation cellulaire somatique a été la fusion entre cellules d’un myélome de souris et lymphocytes d’une souris immunisée. L’hybride obtenu, appelé hybridome , permet d’obtenir des clones cellulaires produisant des anticorps in vitro (figure 3). Ce sont des lignées permanentes produisant des anticorps monospécifiques et homogènes en quantité illimitée. On utilise actuellement en biologie et en médecine des anticorps monoclonaux antiviraux dans un but diagnostique et thérapeutique;

– des anticorps monoclonaux de typage de groupes sanguins ou tissulaires, qui sont des réactifs standardisés, mondialement distribués, pour le typage des transplantations d’organes;

– des anticorps destinés aux colonnes d’affinité sur lesquelles on peut purifier des molécules biologiques d’une manière simple et rapide;

– des anticorps monoclonaux agissant contre des antigènes de différenciation cellulaire présents sur de faibles fractions de populations cellulaires.

La méthode des hybridomes est utilisée pour fabriquer des lignées permanentes possédant des fonctions différenciées, comme des lignées T, ou des lignées hybrides produisant des hormones spécifiques, ou encore des facteurs de croissance cellulaire, du type des interleukines.

En conclusion, depuis la découverte des hybrides somatiques par Georges Barski, Serge Sorieul et Francine Cornefert, il y a une trentaine d’années, la génétique somatique a clairement démontré la fécondité des recherches concernant l’organisation, l’expression et la régulation des gènes chez de nombreuses espèces, y compris l’homme. La possibilité de manipuler et d’introduire du matériel génétique dans des cellules en culture nous permet maintenant d’étudier l’expression des gènes au niveau de la cellule in vitro , mais aussi in vivo dans un organisme entier. Ces méthodes de génétique somatique, ainsi que leur développement moléculaire, sont des outils très importants de la biologie.

Encyclopédie Universelle. 2012.